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플라스미드 및 BAC DNA 분리 프로토콜

  • 5 일본 카지노의 LB + 적합한 항생제에 단일 식민지를 접종하고 37oc에서 16 ~ 20 시간 성장합니다.
  • 피펫 170 일본 카지노의 밤새 배양 물의 500 μl 튜브로 30 μl 글리세롤을 함유하는 500 μl. 믹스하고 –70oc에 보관하십시오.
  • 나머지 배양 물을 데스크탑 원심 분리기에서 1,500g로 10 분 동안 원심 분리하고 상청액을 부어 남은 배양 (남은)에 펠렛을 투표하여 투표하십시오. 0.2 일본 카지노의 용액 I [50mm 포도당, 10mM EDTA 및 25mm Tris (pH 8.0)]를 함유하고 얼음 위에서 5 분 동안 인큐베이션합니다..
  • 0.4 일본 카지노의 새로 준비된 용액 II (0.2 N NAOH 및 1% SDS)를 첨가하고 부드럽게 섞은 다음 얼음 위에서 5 분 동안 배양합니다.
  • 용액 III (3M KAC, pH 5.3-5.5) 0.3 일본 카지노의 용액 III을 추가하고 부드럽게 섞은 다음 -80 C에서 15 분에서 밤새 얼립니다..
  • 실온에서 해동하고 마이크로 포지에서 15 분 일본 카지노 데스크탑 원심 분리기에서 2,800g에서 원심 분리하여 침전물을 수집합니다.
  • 상청액의 0.8 일본 카지노를 새로운 마이크로 튜브로 옮깁니다. 2 일본 카지노 RNase를 추가하고 1 ~ 3 시간을 배양하십시오.
  • 5 분 동안 0.5 일본 카지노의 페놀/클로로포름, 소용돌이 및 원심 분리기를 추가합니다.
  • 0.7 일본 카지노 상청액을 0.7 일본 카지노 이소프로판올, 혼합 및 12,000g에서 5 분 동안 펠렛 DNA로 12,000g에서 원심 분리하는 새로운 튜브로 옮깁니다..
  • 상청액을 제거하고 펠렛을 70% etoh로 씻고 12,000g에서 2 분 일본 카지노 원심 분리합니다.
  • 피펫 팅을 통해 나머지 에탄올 용액을 간략하게 원심 분리하고 제거합니다.
  • 펠렛을 50 일본 카지노 H2O로 녹인다.
  • 5 일본 카지노 H2O 및 1 일본 카지노 10 x 태세 로딩 완충제를 함유하는 튜브로 DNA 용액의 피펫 5 ul. 나머지 DNA 용액을 –70oc에 저장하십시오.
  • 1% 아가 로스 겔에서 하중 완충액에서 DNA를 분석합니다.

솔루션 I : (100 일본 카지노)
포도당 0.9G 50 일본 카지노
EDTA (pH 8.0) 2 일본 카지노의 0.5 m 스톡 10 일본 카지노
Tris-HCL (pH 8.0) 5 일본 카지노의 1 m 스톡 25 일본 카지노

솔루션 II : NAOH-SDS 주식
성분 양 최종 농도
NAOH 1/2 VOLUME의 0.4 N 스톡
(8g/500 일본 카지노)
0.2 N SDS 1/2 볼륨 2% 재고
(10g/500일본 카지노)
1%
*조정 : 사용 직전에 NAOH 및 SDS 주식을 혼합합니다.

솔루션 III :
칼륨 아세테이트 스톡 (pH 4.8-5.3) : (100 일본 카지노)
칼륨 아세테이트 60 일본 카지노의 5 M KOAC
빙하 아세산 28.5 일본 카지노
H2O 11.5 일본 카지노

BCA 단백질 분석 프로토콜 : 분석을 시작하기 전에 샘플 (개별 튜브에서 각각 10일본 카지노)과 BSA 표준을 가져 와서 얼음에 넣습니다. 인큐베이터를 켜서 60oC로 설정하십시오.

일련의 표준 준비 :

레이블 5 마이크로 일본 카지노 5, 10, 20, 40 및 80.
피펫 5, 10, 20, 40 및 80 일본 카지노의 BSA 표준 위의 각각의 각각의 각각의 각각의
추가 튜브에 각각 75, 70, 60, 40 및 0 일본 카지노의 물을 추가합니다.
각 튜브에 10일본 카지노의 샘플 추출 완충액을 추가합니다.

  • 샘플 준비 : 각 샘플 튜브에 80일본 카지노의 물을 추가하십시오.
  • BCA 작업 시약 준비 : 표준을 포함한 10 개의 테스트 샘플의 경우 Pipette 10 일본 카지노의 시약 A를 50 일본 카지노 튜브로 내립니다. Pipette 200 & Mu; L의 시약 B를 A와 혼합하는 동일한 튜브에 넣습니다.
  • 분석 수행 : 각 BSA 표준, 블랭크 및 샘플 튜브에 1일본 카지노의 BCA 작업 시약을 추가하십시오. 모든 튜브를 60oC 수조에서 15 분 동안 그리고 5 분 동안 RT 수조에서 배양하십시오.

식물 단백질 추출 :

  • 액체 질소의 미세 분말로 식물 조직을 갈아냅니다.
  • 2 권의 추출 완충액을 추가하고 조직 샘플을 더 많이 연마합니다 (선택 사항 : 마이크로 프로브로 15 초 일본 카지노 샘플을 소닉합니다..
  • 4OC에서 마이크로 공사에서 30 분 일본 카지노 13,000 rpm에서 회전
  • 상청액을 새로운 깨끗한 일본 카지노로 옮깁니다
    단백질 농도 결정을위한 피펫 10 ul
    나머지는 -80 OC에 보관합니다.

추출 버퍼 :

100 mm Hepes, ph7.5
5 mm EDTA
5 mm EGTA
10 mm DTT
10 mm NA3VO4
10 mm NAF
50 mm B-Glycerophospate
1 mm 페닐 메티 설포 닐 플루오 라이드
5 ug/일본 카지노 antipain
5 ug/일본 카지노 aprotinin
5 ul/일본 카지노 Leupeptin
10% 글리세롤
7.5% 폴리 비닐 폴리피리 롤리돈

SDS 준비/페이지 :

  • 유리 판, 스페이서 및 빗
  • 위의 항목을 95% 에탄올로 닦아서 젤 제작 상자에 설치하십시오.
  • 10% SDS 준비/페이지 분리 젤 솔루션 :
    젤 세트의 바닥과 측면을 밀봉
    젤 솔루션을 젤 세트에 약 1 인치 아래에 도달 할 때까지 젤 세트에 붓습니다
    하단 플레이트의 가장자리
    부탄올로 오버레이 (물 자리 잡은)와 40 분 이상 중합
  • 다음 믹스로 스태킹 젤 만들기 :
  • 8 일본 카지노 물, 4 일본 카지노 상단 겔 완충액, 2.4 일본 카지노 아크릴 아미드 (30%), 2.4 bis,
    200 ul 10% AP 및 10 Ul Temed

분리 겔에서 필터 용지로 부탄올을 빨아냅니다
스태킹 젤 믹스를 젤 세트에 붓습니다
각 겔 세트에 빗을 넣고 20 분 일본 카지노 중합을 놔두십시오.

단백질 추출물 (총 단백질 20 ug)과 4 UL 10X 로딩 완충제 및
워터 (총 40 ul)
샘플 믹스를 10 분 일본 카지노 끓입니다
샘플 믹스를 겔에 마이크로로드하고로드

2 - 3 시간 일본 카지노 60mA에서 젤을 실행하십시오.

버퍼 :
1. 샘플 완충액 (10 일본 카지노) : 1 일본 카지노 글리세롤, 0.5 일본 카지노 2- 메르 캅토 에탄올, 0.23 g SDS, 0.08 g tris,PH 6.8.
2. 런닝 버퍼 (1 L) : 30.3 G Tris Base, 144.0 g 글리신, 10.0 g SDS,pH 8.3.
3. 10 x PBS (포스페이트 완충 식염수) (1 L) : 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4,PH 7.4.

젤 키나제 분석 :

  • 전기 영동 후 버퍼 A로 젤을 3 회 씻으십시오 (RT에서 각각 30 분)
  • 3 번의 버퍼 변경으로 밤새 버퍼 B에서 겔을 인큐베이션합니다
  • RT에서 30 분 일본 카지노 버퍼 C에서 겔을 인큐베이션합니다
  • 겔을 200 nm ATP + 1.85 MBQ G-32P-ATP를 포함하는 10 ~ 20 일본 카지노 버퍼 D에서 겔을 9 분 동안 배양합니다
  • 동일한 솔루션의 적어도 5 번의 변경으로 3 시간 일본 카지노 겔을 3 시간 일본 카지노 인큐베이션합니다.
  • 3mm 필터 용지에 젤을 건조
  • 건조 된 젤을 X-ray 필름에 노출 시키거나 인산기에서 분석하십시오.
  • 버퍼 A :
  • 25 mm Tris-HCl, ph7.5, 0.5 mm DTT, 0.1 mM Na3VO4, 5 mM NAF, 0.5mg/일본 카지노 BSA 및 0.1% Triton X-100
  • 버퍼 B :
  • 25 mm Tris-HCL, ph7.5, 1 mm DTT, 0.1 mm NA3VO4, 5 mm NAF
  • 버퍼 C :
  • 25 mm Tris-HCL, ph7.5, 1 mm DTT, 0.1 mm Na3VO4, 2 mm EGTA, 12 mm mgcl2
  • 버퍼 D :
  • 5% 트리클로로 아세트산 및 1% 인산 나트륨

플라스미드 크기 결정 :

  1. 박테리아를 접종하고 밤새 배양하십시오. (접종기를 잘못 판결하여 교차 오염을 피하고 원래 판에서 끝없는 얼음을 집어 치지 않도록주의해야합니다)
  2. 박테리아 배양을 플레이트에서 개별 일본 카지노로 옮깁니다 (제조업체의 숫자가 일본 카지노의 숫자와 정확히 일치합니다.)
  3. 원심 분리 및 상청액을 제거하십시오.
  4. 박테리아 침전물을 용해시키기 위해 각 일본 카지노와 와류에 30 μL TE를 추가합니다.
  5. 30 μL 페놀/클로로포름 및 소용돌이를 추가하십시오. (유리 및 실험실 코트 착용)
  6. 원심 분리기.
  7. 샘플 버퍼를 포함하는 작은 일본 카지노로 25 μL의 업 플레이어 용액을 전송합니다. (다시 큰 일본 카지노의 숫자가 작은 일본 카지노의 숫자와 정확히 일치하는지 확인하십시오.)
  8. 1% 아가 로스를 얻습니다.
  9. 샘플을 젤의 웰에로드하고 3 시간 일본 카지노 120V로 젤을 실행하십시오.
  10. Biodoc 시스템을 사용하여 사진을 찍으십시오.
  11. 개별 클론의 크기를 비교하고 로그 북에 결과를 기록하십시오. 나중에 참조를 위해 로그 북에 그림을 공격하십시오
남부 블롯 분석 :
  1. 전기 영동이 완료된 후 젤을 촬영하십시오.
  2. 젤의 불필요한 부분을 제거하십시오. 인도 잉크가있는 바늘을 사용하여 마커의 위치를 ​​표시합니다.
  3. 15 분 일본 카지노 1.5m NaCl/0.5 m NaOH의 몇 부피에 젤을 담그면 DNA를 변성합니다.
  4. 그 일본 카지노, whatman 3 mm 종이 절단 (젤 크기보다 큰) 스택을 준비하고,이 종이 컷을 큰 베이킹 접시에 넣고, 1.5 m NaCl/0.5 m NaOH 솔루션으로 종이 절단을 담그십시오.
  5. 원래 밑면이 가장 위에 있지 않도록 젤을 뒤집습니다. 용지 컷과 젤 사이에 젖은 3mm 종이 절단 (기포가 없는지 확인)에 젤을 놓습니다.
  6. Genescreen 막 조각을 자르고 (젤과 동일한 크기) 코팅 된면을 연필로 표시하고, 물에 5 분 일본 카지노 막을 적시십시오..
  7. 멤브레인을 겔에 놓습니다 (코팅 된 측면이 겔을 향하고 겔과 멤브레인 사이에 기포가 없음)..
  8. Whatman 종이의 두 조각 (젤과 같은 크기)을 적시고 개별적으로 막에 넣습니다.
  9. (선택 사항 : 사라 래퍼를 사용하여 베이킹 접시를 덮고 젤 영역 내에서 사라 래퍼를 제거)
  10. Whatman 논문 위에 종이 접시 (젤과 같은 크기)를 넣습니다.
  11. 500g 무게와 함께 스택 위에 유리 판을 스택 상단에 넣습니다.
  12. 밤새 전송하십시오 (솔루션이 충분하지만 젤 수준을 초과하지 않도록하십시오)..
  13. 수건과 Whatman 용지를 제거하십시오. 탈수 된 겔을 뒤집고 막과 함께 whatman 종이의 마른 시트에 놓으십시오.
  14. 껍질을 벗기고 젤을 버립니다. 멤브레인을 6 x SSC/200 mm 트리스, pH7.5 버퍼에 5 분 일본 카지노 담그십시오.
  15. 필터는 이제 혼성화 준비가되었습니다.

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